PCR儀已經成為分子生物學、醫學、食品工業、司法科學、生物技術、環境科學、微生物學、臨床診斷、流行病學、遺傳學、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達等領域廣泛應用的一種實驗室儀器。PCR儀在操作中常會遇到哪些問題呢?該如何解決呢?
PCR在產物序列中引入了錯誤,這大多是由于聚合酶忠實性低或者循環數太多,這時需要使用帶有校正活性的熱穩定聚合酶,同時降低循環數。此外,四種dNTP的濃度不同也會出現該問題,此時應制備新的濃度相同的dNTP混合物。
PCR跑膠,目的條帶很亮,但是邊沿不清楚,前后有拖尾現象。出現這樣的問題,則需要進行細致的分析,因為引起該問題的可能很多。可先檢查是否模板質量問題,如有降解等,模板應避免反復凍融。也有可能是抽提RNA時有污染,則需要重新抽提RNA。此外,也可能是非特異性擴增引發該問題,可提高退火溫度,少循環次數。電泳緩沖液時間太長,ph值和鹽離子濃度明顯改變、電泳時電壓太高、電泳液過久沒換,電泳膠臟了等都可能引發該問題。如果不是由上述原因引起,則進一步檢查加樣量是否過大,制膠過程中膠孔是否制好,EB是否沖洗干凈、模板中是否混有基因組DNA或蛋白等。也需考慮是否擴增的條件不合適。針對具體原因再采取相應的措施。
PCR產物何時需要用凝膠純化,何時不需要?當凝膠分析擴增產物只有一條帶時,則不需要使用凝膠純化。當可見其他雜帶時,則可能是積累了大量引物的二聚體,在克隆前需要做凝膠純化。
如果實驗中沒有回收到目的片段,則需要繼續進行對照實驗。包括涂布未轉化的感受態細胞、轉化完整質粒,計算菌落生長數,測定轉化效率、用pGEM-T或pGEM-TEasy載體,連接pGEM-T正對照,轉化高頻率感受態細胞,按照的實驗步驟進行。
實驗中出現假陽性擴增該怎么辦?這是擴增系統受到污染的表現,應通過檢查排除污染源。首先考慮是否為試劑污染,可將試劑分裝好直接置于PCR儀中擴增進行判斷。其次要考慮是否為實驗室污染,可更換所用的移液器、吸咀管(離心管)等,將試驗中的關鍵步驟轉移到一個新的環境中,判斷是否為實驗室污染。如果是則需要對整個實驗室及實驗器材*清洗處理,保持良好的通風、清潔等。此外,還要考慮是否為采樣污染,一般表現為一批結果陽性率很高,一批結果陽性率又下降很多,如此反復。解決方法為盡量使用一次試管及吸咀取樣。